骨組織RNA快速提取試劑盒
 

　　產(chǎn)品信息
 

　　產(chǎn)品名稱產(chǎn)品編號規(guī)格
 

　　骨組織RNA快速提取試劑盒
 

　　產(chǎn)品描述
 

　　骨組織堅硬、骨細(xì)胞密度低、而且外周基質(zhì)含有大量黏蛋白(蛋白多糖)和RNA難以分離，無法用傳統(tǒng)Trizol法進(jìn)行高質(zhì)量提取。本試劑盒采用的不含苯酚/氯仿配方的裂解液，并添加多種成分去除骨組織蛋白多糖。同時基因組DNA清除柱技術(shù)可以有效清除gDNA殘留，得到的RNA一般不需要DNase消化，可用于反轉(zhuǎn)錄PCR、熒光定量PCR等實驗。裂解液迅速裂解細(xì)胞和滅活細(xì)胞RNA酶， 離心沉淀去除多糖和次級代謝產(chǎn)物，然后裂解混合物用乙醇調(diào)節(jié)RNA結(jié)合吸附到基因組DNA清除柱，然后RNA被選擇性洗脫濾過， 吸附在基因組DNA清除柱上的殘留DNA無法洗脫連同柱子一起丟棄從而清除掉DNA。濾過的RNA用乙醇調(diào)節(jié)結(jié)合條件后，RNA在高離序鹽狀態(tài)下選擇性吸附于離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜，再通過一系列快速的漂洗-離心的步驟，去蛋白液和漂洗液將細(xì)胞代謝物，蛋白等雜質(zhì)去除， 最后低鹽的RNase free H20將純凈RNA從硅基質(zhì)膜上洗脫。
 

　　運輸和保存方法
 

　　1)本試劑盒在室溫儲存12個月不影響使用效果。
 

　　2)不合適的儲存于低溫(4℃或者-20℃)會造成溶液沉淀，影響使用效果，因此運輸和儲存均在室溫下(15℃-25℃)進(jìn)行。
 

　　3)避免試劑長時間暴露于空氣中產(chǎn)生揮發(fā)、氧化、PH值變化，各溶液使用后應(yīng)及時蓋緊蓋子。
 

　　注意事項
 

　　1.所有的離心步驟均可在室溫完成(4℃離心也可以)，使用轉(zhuǎn)速可以達(dá)到13,000 rpm的傳統(tǒng)臺式離心機(jī)，如Eppendorf 5415C 或者類似離心機(jī)。
 

　　2.需要自備乙醇，研缽或者其它合適的破碎骨組織裝置。
 

　　3.樣品處理量絕對不要超過基因組清除柱DA和和RNA吸附柱RA處理能力，否則造成DNA殘留或產(chǎn)量降低。開始摸索實驗條件時，如果不清楚樣品DNA/RNA含量時可使用較少的樣品處理量， 將來根據(jù)樣品試驗情況增加或者減少處理量。
 

　　4.裂解液CLB和RLT Plus 和去蛋白液RW1中含有刺激性化合物，操作時戴乳膠手套，避免沾染皮膚，眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時，要用大量清水或者生理鹽水沖洗。
 

　　5.關(guān)于DNA 的微量殘留:
 

　　1)選用跨內(nèi)含子的引物，以穿過mRNA中的連接區(qū)，這樣DNA就不能作為模板參與擴(kuò)增反應(yīng)。
 

　　2)選擇基因組DNA和cDNA上擴(kuò)增的產(chǎn)物大小不一樣的引物對。
 

　　3)將RNA提取物用RNase-free的DNase I 處理。本試劑盒還可以用于DNase I處理后的RNA清潔(cleanup) ，請聯(lián)系我們索取具體操作說明書。
 

　　4)在步驟去蛋白液RW1漂洗前，直接在吸附柱RA上進(jìn)行DNase I柱上消化處理。購買DNA酶柱上消化試劑盒(貨號：RN34)前可先索取具體操作說明書。。
 

　　6.本產(chǎn)品僅作科研用途!
 

　　使用方法
 

　　提示：
 

　　→第一次使用前請先在漂洗液RW瓶中加入指定量無水乙醇!
 

　　→取1ml裂解液 CLB至離心管內(nèi)(如果CLB有析出或者沉淀需先置于65°C水浴重新溶解)，在裂解液CLB中加入100μl PLANTaid，顛倒混勻后65°C水浴中預(yù)熱。多個樣品按照比例放大準(zhǔn)備
 

　　1.液氮研磨法:
 

　　1)骨鉗夾碎骨組織后放入研缽(研缽在180度干烤2小時)，加入液氮后反復(fù)研磨成細(xì)粉，注意液氮蒸發(fā)后不斷補(bǔ)加保存液氮一直存在。
 

　　2)轉(zhuǎn)移30mg-150mg細(xì)粉加至預(yù)熱的裂解液CLB(已加有PLANTaid)離心管中。立即劇烈渦旋30-60秒或者用吸頭吹打混勻裂解直得到滿意勻漿結(jié)果(或者電動勻漿30秒)，可以剪切DNA，降低粘稠度和提高產(chǎn)量。
 

　　骨組織差異極大，用戶應(yīng)該根據(jù)不同骨組織的具體情況和實驗結(jié)果增減或者減少處理的樣品量。以獲得更好的產(chǎn)量和純度。
 

　　立刻接操作步驟的步驟3。
 

　　2.其它骨組織破碎方法：
 

　　1)取30mg-150mg骨組織加入1ml預(yù)熱的裂解液CLB(已加有PLANTaid)高速均質(zhì)儀粉碎勻漿?；蛘呷?0mg-150mg液氮冷凍包埋切片粉碎的骨頭加入裂解液CLB(已加有PLANTaid)粉碎勻漿。
 

　　2)立刻接操作步驟的步驟3。
 

　　3.短時放回 65°C水浴中(10 min)，中間偶爾顛倒1-2次幫助裂解。
 

　　4.將裂解物4°C 13,000 rpm離心10分鐘，沉淀不能裂解的碎片。
 

　　5.取裂解物上清(在不超過基因組DNA清除柱能力的情況下可以取更多的上清，這樣可以提高產(chǎn)量)轉(zhuǎn)到一個新離心管。加入上清體積一半的無水乙醇(0.5體積)，此時可能出現(xiàn)沉淀，但是不影響提取過程，立即吹打混勻，不要離心。
 

　　若上清表面有漂浮物，用吸頭挑開吸取下面液體即可。
 

　　6.將混合物(每次小于720μl，多可以分兩次加入)加入一個基因組清除柱中，(清除柱放入收集管中)13,000 rpm離心2分鐘，棄掉廢液。
 

　　確保離心后液體全部濾過去，膜上沒有殘留，如有必要，可以加大離心力和離心時間。
 

　　7.將基因組DNA清除柱子放在一個干凈2ml離心管內(nèi)(不用RNAse free 或者DEPC處理，一般干凈的新離心管即可。也可使用RNA吸附柱配套的新的干凈收集管)，在基因組清除柱內(nèi)加500μl裂解液RLT Plus，13,000 rpm離心30秒， 收集濾液(RNA在濾液中)，用微量移液器較精確估計濾過液體積(通常為450-500μl左右，濾過時候損失體積應(yīng)該減去)，加入0.5倍體積的無水乙醇，此時可能出現(xiàn)沉淀，但是不影響提取過程，立即吹打混勻，不要離心。
 

　　8.立刻將混合物(每次小于720μl，多可以分兩次加入)加入一個吸附柱RA中，(吸附柱放入收集管中)13,000 rpm離心2分鐘，棄掉廢液。
 

　　確保離心后液體全部濾過去，膜上沒有殘留，如有必要，可以加大離心力和離心時間。
 

　　9.加700μl 去蛋白液RW1，室溫放置1分鐘，13,000rpm 離心30秒，棄掉廢液。
 

　　10.加入500μl漂洗液RW(請先檢查是否已加入無水乙醇!)，13,000 rpm 離心30秒，棄掉廢液。加入500μl漂洗液RW，重復(fù)一遍。
 

　　11.將吸附柱RA放回空收集管中，13,000 rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液, 以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)。
 

　　12.取出吸附柱RA，放入一個RNase free離心管中，根據(jù)預(yù)期RNA產(chǎn)量在吸附膜的中間部位加30-50μl RNase free water(事先在 70-90℃水浴中加熱可提高產(chǎn)量)， 室溫放置1分鐘，12,000 rpm 離心1分鐘。
 

　　洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于30 μl，體積過小影響回收效率。如果需要得到更大濃度的RNA，將離心得到的RNA溶液加回到吸附柱重復(fù)洗脫一遍。
 

　　注：以上資料僅供參考，不作為實驗數(shù)據(jù)，具體請咨詢品牌供應(yīng)商或技術(shù)老師;
 

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